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關(guān)于細胞和組織療法的內(nèi)毒素檢測闡述

發(fā)布時間: 2023-12-04  點擊次數(shù): 1148次

一、介紹

在科學(xué)進步和希望利用這些進步的新投資的推動下,研究人員和臨床醫(yī)生正在開發(fā)創(chuàng)新的細胞療法。出于兩個原因,控制此類治療制劑中的內(nèi)毒素污染非常重要。首先,由于內(nèi)毒素會對受體產(chǎn)生影響,因此給患者注射的制劑不能受到嚴重污染。其次,內(nèi)毒素是多種細胞反應(yīng)的強效誘導(dǎo)劑,可能會改變細胞的治療價值。

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二、細胞療法解析

以細胞和組織為基礎(chǔ)的療法(本文中稱為細胞療法)是一種特殊的腸外產(chǎn)品,其中給患者注射的是活細胞。細胞可以來自患者(自體),這樣可以防止對細胞的免疫反應(yīng)。另一種方法是從另一個人身上采集細胞(異體來源),在這種情況下,供體組織可能與受體匹配,以減少對療法的免疫反應(yīng),但這種療法通常需要使用免疫抑制藥物。第三種方法是使用異種細胞(從其他物種獲得的細胞),這可能也需要使用免疫抑制藥物。

將細胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中用于后續(xù)的儲存、生長、操作、轉(zhuǎn)化或收獲以及其任何組合。在簡單的治療形式中,細胞無需對之前收獲的自身細胞進行任何操作即可返回患者體內(nèi)。這通常是在治療減少淋巴細胞計數(shù)后進行的。對于其他療法,可以在使用之前操作或刺激所使用的細胞或組織。

細胞療法可以通過輸注藥物、注射或手術(shù)植入,以聚集形式或具有支撐或封裝材料,可被視為醫(yī)療器械的物品。供者通常是患者體內(nèi)的細胞通常是無菌的,并且不含可檢測到的內(nèi)毒素。令人擔憂的是,它們在收集、儲存、操作(如果適用)和返回患者體內(nèi)的過程中會受到污染。

三、內(nèi)毒素的意義

內(nèi)毒素是一種有效的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。如果在細胞治療中作為污染物存在,可能會影響患者和/或被施用的細胞。第一個問題是對患者的潛在影響,這對于接觸血液、淋巴系統(tǒng)或腦脊液的其他注射產(chǎn)品和醫(yī)療器械來說很常見。這些產(chǎn)品穿透或繞過皮膚和腸壁的保護屏障,有可能將內(nèi)毒素直接引入血液。通過口腔攝入的內(nèi)毒素通常不會對健康造成有害影響,因為它不會穿過腸壁進入血液。內(nèi)毒素是由口腔和腸道中的細菌產(chǎn)生的它存在于食物和自來水中,有時濃度超過1000EU/mL。相反,內(nèi)毒素如果進入血液,會引起發(fā)燒(熱原反應(yīng))和一系列其他可能的影響,包括感染性休克和死亡,這是危險的。因此,將治療劑直接引入患者血液的治療方法,如注射、輸注或作為醫(yī)療設(shè)備,必須控制內(nèi)毒素污染。

第二個考慮因素是內(nèi)毒素對待給藥細胞的影響。內(nèi)毒素對細胞的影響在《LAL更新》第16卷第1期生物技術(shù)細胞培養(yǎng)中進行了討論。同樣的原理也適用于細胞治療。關(guān)注的影響包括有絲分裂的誘導(dǎo)、細胞因子的刺激產(chǎn)生(細胞因子本身可能是熱原性的)、形態(tài)變化和細胞毒性。因此,在存在內(nèi)毒素的情況下,所給藥的細胞的性質(zhì)可能與預(yù)期的不同。這種污染可能導(dǎo)致治療失敗,正如Vargas等人1在胰島移植的情況下提出的那樣。

沒有太多的法規(guī)和指導(dǎo)文件專門針對細胞治療的內(nèi)毒素污染。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)文件《人類體細胞治療和基因治療指南》提出了幾點。2內(nèi)毒素檢測要求與其他胃腸外產(chǎn)品的要求一致。在第III部分細胞基因治療產(chǎn)品的特性和釋放測試中,法規(guī)指出最終產(chǎn)品和生產(chǎn)過程和使用的材料應(yīng)經(jīng)過QC測試。在純度"B部分標題下,該文件建議驗證用于檢測內(nèi)毒素的合適的LAL測試方法。也就是說,必須證明所測試的細胞制劑不會干擾LAL測試檢測內(nèi)毒素的能力。該指南引用了美國食品藥品監(jiān)督管理局1983年的《鱟試劑裂解物試驗驗證指南》。第八節(jié):“臨床前評估……"未提及內(nèi)毒素(LAL)檢測或熱原(兔子)檢測。在這個階段可能會考慮熱原測試,但指南中沒有說明。由于許多細胞療法產(chǎn)生熱原性細胞因子,熱原檢測呈陽性可能不表明內(nèi)毒素污染。

歐洲藥品評估機構(gòu)(EMEA)于2001年發(fā)布了“關(guān)于人類體細胞治療藥品生產(chǎn)和質(zhì)量控制的考慮要點"4。在標題“其他材料和試劑的來源和特性"下,聲明“應(yīng)確保輔助產(chǎn)品的低內(nèi)毒素水平"。在給藥之前,沒有關(guān)于使用LAL的細胞治療產(chǎn)品的釋放測試的具體聲明。

四、實際考慮

未稀釋的細胞懸浮液可能會干擾光度法(比濁法和顯色法)。因此,du Moulin和同事5使用凝膠凝塊法檢測外周血單核細胞,然后再將其送回患者體內(nèi)進行自淋巴細胞治療。這些作者對作為細菌污染指標的內(nèi)毒素的潛力很感興趣。在隨后的一篇論文中,該研究小組介紹了一種光度(顯色)測定法的驗證情況。

不同類型的細胞制劑可能具有不同的干擾特性。此外,來自不同供體的相同類型的細胞制劑也可能具有不同的抑制(或增強)模式。為了解決這些可能的差異,方法開發(fā)應(yīng)該產(chǎn)生一個堅固的測試,以便通過對干擾因素進行測試,可以對三個不同批次的治療制劑(最好使用來自三個不同來源的細胞)進行測試驗證。盡管盡了最大努力來開發(fā)一種堅固的測試,但可能仍然有必要在測試程序中建立靈活性,以克服來自麻煩樣本的干擾。如果克服干擾需要改變樣品的處理方式,則當超過原始驗證的參數(shù)時,應(yīng)對修改后的處理方式進行干擾因素測試。

另一個實際考慮因素是(1,3-β-D-葡聚糖污染可能導(dǎo)致LAL檢測結(jié)果假陽性(即無內(nèi)毒素)。Anderson等人7報道了用于HIV免疫臨床試驗的自體樹突狀細胞LAL凝膠凝塊試驗呈陽性。在這種情況下,污染源被證明是硝酸纖維素過濾器。與內(nèi)毒素一樣,葡聚糖是生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑,但在任何藥典或監(jiān)管文件中都沒有對葡聚糖的限制。因此,葡聚糖有可能影響細胞療法的性質(zhì)和/或影響該療法的接受者。FDA規(guī)定,LAL檢測陽性不合格的結(jié)果必須被認為是不合格的,除非有其他證明。葡聚糖特異性LAL試劑(GlucatellACC目錄號GT002)和葡聚糖特異性LA測試(使用Gluchield葡聚糖阻抑制沖液,ACC目錄編號GB0051)可以幫助區(qū)分內(nèi)毒素和葡聚糖污染。建議對纖維素過濾器進行葡聚糖測試,以避免LAL測試呈陽性以及葡聚糖對細胞的可能影響。

檢測細胞療法中的內(nèi)毒素是具有挑戰(zhàn)性的,因為所測試的材料可能隨著供體的血液化學(xué)而變化。在對患者進行細胞治療之前,執(zhí)行LAL以提供結(jié)果的技術(shù)人員經(jīng)常面臨緊迫的時間壓力。因此,重要的是,測試方法要堅固耐用,不易受到干擾,因為干擾會導(dǎo)致測試無效,需要重復(fù)測試。稀釋樣品的能力對于獲得準確的內(nèi)毒素檢測結(jié)果至關(guān)重要。光度法明顯比凝膠凝塊法更靈敏,最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)也大大提高因此,這些方法可以對樣品進行更大程度的稀釋,以克服干擾和減少懸浮細胞造成的渾濁。使用Pyros Kinetix® Flex96細菌內(nèi)毒素定量檢測系統(tǒng)的光度技術(shù)的儀器和試劑,在中國大陸可聯(lián)系科德角國際購買美國ACC產(chǎn)品。Pyros Kinetix® Flex細菌內(nèi)毒素定量檢測系統(tǒng)是可用的靈敏的內(nèi)毒素檢測系統(tǒng),它提供了最大的MVD和稀釋范圍,以克服干擾。

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Pyros Kinetix® Flex細菌內(nèi)毒素定量檢測系統(tǒng)

五、結(jié)論

適用于腸外產(chǎn)品或醫(yī)療器械內(nèi)毒素檢測的原則同樣適用于細胞療法。關(guān)于內(nèi)毒素對接受者的影響也有類似的擔憂,這推動了合規(guī)性要求。然而,活細胞治療帶來了額外的風(fēng)險,即內(nèi)毒素可能會影響細胞的特性及其治療價值。由于這兩個原因,細胞療法的內(nèi)毒素檢測是非常重要的。由于內(nèi)毒素可能會改變細胞的特性,強烈建議從潛在治療研究的早期階段開始監(jiān)測內(nèi)毒素污染。此外,對內(nèi)毒素控制重要性的早期認識將確保在轉(zhuǎn)移到cGMP生產(chǎn)過程中時,也會轉(zhuǎn)移關(guān)于內(nèi)毒素控制的適當考慮。

參考文獻:

1.Vargas, Francesca  Vives-Pi, Marta  Somoza, Nuria ; Armengol, Pilar; Alcalde, Laura; Marti, Merce; Costa, Manuela; Serradell, Laurence; Dominguez, Orlando Fernandez-Llamazares, Jaume; Julian, Joan F.; Sanmarti, Anna; Pujol-Borrell, Ricardo. 1998. Endotoxin contamination may be responsible for the unexplained failure of human pancreatic islet transplantation. Transplantation. 655:722-727.

2.“Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy." US. US Food and rug Administration, Rockville, MD, 1998.

3.“Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate test as an End- Product Endotoxin Test for Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products, and Medical Devices." US Food and Drug Administration, Rockville, MD, 1987.

4.“Points to Consider on the Manufacture and Quality Control of Human Somatic Cell Therapy Medicinal Products." European Agency for the Evaluation of Medicinal Products EMEA, London, 2001.

5.du Moulin, G. C., Liu, V., and Osband, M. E. 1992. Limulus amebocyte lysate LAL assay in living cell therapies. Biopharm. 5: 32-54.

6.Pitkin, Zorina, Prakash Chhugani, Aaron Chenette, Yuan-Jin Shen, Gary C. du Moulin. 1996. Validation of an automated method of endotoxin testing for use in the end-product testing of ex vivo activated T-lymphocytes used in a somatic cell therapy. Biotechnology and Bioengineering, 505: 541 – 547.

7.Anderson, J., M. Eller, M. Finkelman, D. Birx, S. Schlesinger-Frankel, M. Marovich. 2002. False positive endotoxin results in a DC product caused by 1-->3-beta-D-glucans acquired from a sterilizing cellulose filter. Cytotherapy. 46:557-559.


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