摘要

檢測(cè)生物制藥產(chǎn)品中可能存在的內(nèi)毒素對(duì)患者安全至關(guān)重要。雖然內(nèi)毒素分子本身是高度穩(wěn)定的，但基質(zhì)成分、儲(chǔ)存溫度和容器組成等各種因素都會(huì)影響其在制造收集并隨后檢測(cè)內(nèi)毒素含量的樣品時(shí)的穩(wěn)定性。

位于馬薩諸塞州安多弗的輝瑞制藥公司開(kāi)發(fā)了一個(gè)程序，用于創(chuàng)建內(nèi)部天然內(nèi)毒素（NOE）制劑，以評(píng)估內(nèi)毒素在不同基質(zhì)、溫度和容器中的穩(wěn)定性。使用NOE比使用市售的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）更有優(yōu)勢(shì)，如增加實(shí)驗(yàn)室的靈活性和控制，輝瑞公司已使用內(nèi)部天然內(nèi)毒素（NOE）制劑來(lái)評(píng)估內(nèi)毒素在不同基質(zhì)和溫度下的穩(wěn)定性。

介紹

內(nèi)毒素是一種脂多糖結(jié)構(gòu)，位于革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中。由于內(nèi)毒素屬于一類被稱為熱原的致熱物質(zhì)，因此可能含有內(nèi)毒素的腸外用藥產(chǎn)品會(huì)引起患者的熱原反應(yīng)。

FDA規(guī)定的內(nèi)毒素限值為5EU/kg體重。超過(guò)此含量的內(nèi)毒素限值可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)燒、休克和死亡。出于安全性和合規(guī)性的考慮，在生物制造過(guò)程和產(chǎn)品中監(jiān)測(cè)和控制內(nèi)毒素含量至關(guān)重要。

鱟試劑（LAL）檢測(cè)法通常用于檢測(cè)生物制品中的內(nèi)毒素含量。檢測(cè)貫穿于整個(gè)純化過(guò)程以及原料藥和成品藥生產(chǎn)過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)。有效的內(nèi)毒素檢測(cè)對(duì)于產(chǎn)品的安全性非常重要。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)產(chǎn)品生產(chǎn)和釋放過(guò)程中可能存在的任何內(nèi)毒素至關(guān)重要。

盡管人們普遍認(rèn)為內(nèi)毒素分子本身具有高度穩(wěn)定性，但各種基質(zhì)、溫度和/或儲(chǔ)存容器都可能影響鱟試劑（LAL）檢測(cè)法檢測(cè)內(nèi)毒素存在的能力。在馬薩諸塞州安多弗的輝瑞?？谱o(hù)理中心啟動(dòng)了多項(xiàng)研究來(lái)探討這些影響。 為了測(cè)量時(shí)間和/或溫度對(duì)內(nèi)毒素回收的影響，有必要在起始生物制藥樣品中加入內(nèi)毒素。由于要對(duì)多種基質(zhì)和溫度進(jìn)行評(píng)估，因此需要大量的內(nèi)毒素才能完成這些研究。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）是一種商業(yè)上可用的內(nèi)毒素類型。CSE用于為鱟試劑（LAL）檢測(cè)法準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)曲線和陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照（PPC）。CSE由獲得許可的鱟試劑供應(yīng)商從純化的大腸桿菌菌株中制備，并在配方中含有填充劑。因此，CSE并不代表實(shí)際污染事件中可能存在的內(nèi)毒素。此外，CSE通常不適用于高濃度的EU/mL配方。

自然產(chǎn)生的內(nèi)毒素（NOE）由革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生，經(jīng)過(guò)過(guò)濾但未經(jīng)進(jìn)一步處理，使其成為污染事件的代表性物質(zhì)。此外，由于它可以培養(yǎng)到非常高的EU/mL濃度，因此適合用于加標(biāo)研究。

生物體的選擇

對(duì)多種革蘭氏陰性生物體進(jìn)行篩選以產(chǎn)生NOE，以確定用于產(chǎn)生NOE制劑的潛在候選物。所有NOE溶液均通過(guò)在胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA）上制備草坪培養(yǎng)物并在32°C下孵育24-48小時(shí)來(lái)制備。從培養(yǎng)皿中取出菌落，接種到胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）中，在32°C的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。將所得培養(yǎng)物離心，用0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾，并使用動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素。表1-1列出了所評(píng)估的每種生物的EU/mL值。

先前在馬薩諸塞州安多佛的輝瑞公司基地使用大腸桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌制劑進(jìn)行的NOE加標(biāo)研究非常有用，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生了高濃度的EU/mL儲(chǔ)備溶液，并且在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。產(chǎn)生高濃度內(nèi)毒素的生物體特別適用于加標(biāo)研究，因?yàn)檫@些制劑可以靈活地測(cè)試低和高的加標(biāo)濃度。

由于這些制劑產(chǎn)生的內(nèi)毒素濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)使用時(shí)的水平，因此每次使用前都必須確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室制備的NOE儲(chǔ)存液的濃度，以便制備準(zhǔn)確的加標(biāo)溶液。

LAL驗(yàn)證與LAL加標(biāo)研究

在產(chǎn)品生產(chǎn)和發(fā)布過(guò)程中對(duì)LAL檢測(cè)進(jìn)行常規(guī)使用驗(yàn)證時(shí)，會(huì)將CSE形式的內(nèi)毒素作為PPC添加到已稀釋的樣品中，以評(píng)估基質(zhì)抑制/增強(qiáng)作用。驗(yàn)證活動(dòng)重點(diǎn)關(guān)注干擾因素測(cè)試，通過(guò)確定PPC加標(biāo)回收率（即，加標(biāo)到PPC中的內(nèi)毒素的回收率必須達(dá)到 50-200%）來(lái)評(píng)估樣品基質(zhì)是否會(huì)干擾內(nèi)毒素檢測(cè)。當(dāng)加標(biāo)回收率在可接受的PPC加標(biāo)回收范圍內(nèi)，并且與USP第<85>章中設(shè)定的參數(shù)一致時(shí)，選擇樣品稀釋。

LAL驗(yàn)證研究的設(shè)計(jì)通常會(huì)考慮到樣品基質(zhì)的影響，即樣品稀釋到一定程度后，檢測(cè)中不再出現(xiàn)干擾，這是由稀釋樣品中PPC加標(biāo)回收率決定的。在這種情況下，PPC中的內(nèi)毒素只有在稀釋后才會(huì)與樣品發(fā)生作用，而不是在開(kāi)始時(shí)。

為了確定樣品基質(zhì)對(duì)內(nèi)毒素的影響，在進(jìn)行常規(guī)LAL檢測(cè)之前，內(nèi)毒素必須與未稀釋的樣品基質(zhì)相互作用。

使用NOE最初加標(biāo)未稀釋的樣品更能代表污染事件，因?yàn)檫@種污染的來(lái)源很可能是細(xì)菌來(lái)源，而不是來(lái)自加工后的內(nèi)毒素來(lái)源（如CSE）。

PPC加標(biāo)和NOE加標(biāo)的作用之間的主要區(qū)別在于，PPC加標(biāo)提供有關(guān)樣品基質(zhì)是否干擾檢測(cè)本身的檢測(cè)措施的信息，而NOE加標(biāo)提供有關(guān)樣品基質(zhì)與內(nèi)毒素直接相互作用的信息。圖1說(shuō)明了使用動(dòng)力學(xué)LAL檢測(cè)法進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)和NOE加標(biāo)研究之間的區(qū)別。

保持時(shí)間研究的設(shè)計(jì)

在許多情況下，LAL樣品運(yùn)到檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室后，要放置一段時(shí)間才能開(kāi)始檢測(cè)。應(yīng)進(jìn)行研究，以評(píng)估該保持時(shí)間對(duì)特定樣品類型內(nèi)毒素回收的影響。NOE對(duì)于這些研究非常有用，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室可以很容易地制備和儲(chǔ)存高濃度的EU/mL儲(chǔ)存液，從而可以相對(duì)簡(jiǎn)單地制備出各種內(nèi)毒素濃度的加標(biāo)樣品。

在進(jìn)行LAL檢測(cè)之前，通過(guò)在未稀釋的樣品中添加NOE來(lái)進(jìn)行保持時(shí)間研究。立即對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行分析以確定起始濃度，并在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)儲(chǔ)存和分析等分試樣。通過(guò)在未稀釋的樣品中加入NOE，可以在初始時(shí)間點(diǎn)以及樣品的儲(chǔ)存時(shí)間和溫度下確定產(chǎn)品和基質(zhì)對(duì)可能存在的任何內(nèi)毒素的影響。在這些研究中使用動(dòng)力學(xué)LAL測(cè)定法，因?yàn)榻Y(jié)果是定量的，可以確定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的內(nèi)毒素量。

表1-2顯示了在2-8°C溫度下將兩種不同的緩沖液保持3周時(shí)，使用摻入NOE的兩種緩沖液進(jìn)行保持時(shí)間研究的結(jié)果，表1-3顯示了在-80°C溫度下，將兩種緩沖液保持3個(gè)月時(shí)，使用摻入相同兩種緩沖液進(jìn)行保持時(shí)間研究的結(jié)果。這些結(jié)果表明，無(wú)論在何種溫度下，內(nèi)毒素都可以從緩沖基質(zhì)中回收。

保持時(shí)間研究的一個(gè)重要考慮因素是確認(rèn)最初加入的內(nèi)毒素量。當(dāng)NOE加入后直接測(cè)定起始時(shí)間點(diǎn)時(shí)，必須考慮樣品基質(zhì)是否對(duì)內(nèi)毒素回收率有直接影響。為了證明沒(méi)有樣品基質(zhì)干擾，在無(wú)熱原水（LRW） 中進(jìn)行了相同的加標(biāo)。表1-4說(shuō)明了此無(wú)熱原水加標(biāo)確認(rèn)的使用情況。本研究使用了三種不同的NOE加標(biāo)水平，由目標(biāo)NOE加標(biāo)量表示。測(cè)試樣品和無(wú)熱原水欄下的實(shí)際回收量在LAL測(cè)定可變范圍內(nèi)，且表明不存在樣品基質(zhì)的干擾。

起始時(shí)間點(diǎn)測(cè)試和使用NOE進(jìn)行故障排除

以下研究（表1-5）清楚地說(shuō)明了在無(wú)熱原水中對(duì)起始時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行加標(biāo)確認(rèn)的重要性。將NOE加標(biāo)到測(cè)試樣品中并立即進(jìn)行測(cè)定以確定起始NOE濃度。NOE以三種不同的濃度加標(biāo)，由目標(biāo)NOE加標(biāo)表示。在所有三種加標(biāo)水平的稀釋度測(cè)試中，內(nèi)毒素回收率均低于檢測(cè)限值。然而，由于沒(méi)有進(jìn)行無(wú)熱原水確認(rèn)，因此很難確定是否存在稀釋或測(cè)定誤差，或?qū)嶋H的基質(zhì)或產(chǎn)品干擾。

這項(xiàng)研究以兩種不同的加標(biāo)水平重復(fù)進(jìn)行，無(wú)熱原水確認(rèn)樣品與測(cè)試樣品同時(shí)進(jìn)行（表1-6）。添加無(wú)熱原水確認(rèn)樣品清楚地表明，樣品基質(zhì)存在干擾，導(dǎo)致檢測(cè)樣品中無(wú)法檢測(cè)到內(nèi)毒素。

在這種情況下，需要進(jìn)行多項(xiàng)研究來(lái)確定樣品基質(zhì)干擾的原因。 使用實(shí)驗(yàn)室制備的NOE儲(chǔ)存液提高了實(shí)驗(yàn)室在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多項(xiàng)研究的效率，并允許使用從5EU/mL到3500 EU/mL的加標(biāo)濃度。表1-7顯示了一項(xiàng)使用不同測(cè)試樣本的研究數(shù)據(jù)，該樣本的 NOE加標(biāo)非常低（5-40 EU/mL）。在這種情況下，測(cè)試樣本和無(wú)熱原水確認(rèn)樣本的內(nèi)毒素回收率是一致的，表明沒(méi)有基質(zhì)干擾。

研究人員還使用了來(lái)自幾種不同生物的制備物，為收集到的數(shù)據(jù)增加了穩(wěn)定性和可變性。這突出了使用內(nèi)部NOE制備物的額外好處，因?yàn)閬?lái)自多種生物的制劑可以在需要時(shí)快速制備和使用。

表1-8顯示了使用表1-5和表1-6中的相同測(cè)試樣本生成的部分?jǐn)?shù)據(jù)，其中有來(lái)自高濃度EU/mL NOE生成物（粘質(zhì)鏈霉菌）和低濃度EU/mL NOE生成物（A. 基因組）的加標(biāo)。 兩者的目標(biāo)濃度均為200 EU/mL，并顯示出相似的回收率，進(jìn)一步表明測(cè)試樣品干擾了內(nèi)毒素的回收，而不是任何檢測(cè)錯(cuò)誤或特定內(nèi)毒素來(lái)源的問(wèn)題。

結(jié)論

本報(bào)告中提供的數(shù)據(jù)用于說(shuō)明測(cè)試各種基質(zhì)、溫度和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)在測(cè)試前將在實(shí)驗(yàn)室中放置一段時(shí)間的樣品的內(nèi)毒素回收的干擾的重要性。了解內(nèi)毒素和樣品基質(zhì)在起始時(shí)間點(diǎn)的相互作用尤為重要，因?yàn)榇藭r(shí)可能存在的任何基質(zhì)抑制都會(huì)被識(shí)別。在執(zhí)行此測(cè)試或?qū)υ贜OE被摻入測(cè)試樣品基質(zhì)時(shí)表現(xiàn)出抑制的基質(zhì)進(jìn)行故障排除時(shí)，使用實(shí)驗(yàn)室制備的NOE原液大大增加了可用的測(cè)試選項(xiàng)的靈活性、效率和范圍。當(dāng)在起始時(shí)間點(diǎn)遇到基質(zhì)抑制時(shí)，需要開(kāi)發(fā)替代測(cè)試方法，在這種情況下NOE也非常有用，因?yàn)榇_認(rèn)內(nèi)毒素是否成功回收對(duì)于任何替代方法的實(shí)施都至關(guān)重要。